Новая вселенная мини-протеинов в корне меняет клеточную биологию и генетику

Мыши посрамили бегунов-людей. Несмотря на свои крошечные шажочки, грызуны способны преодолевать на тренировочном колесе по десять километров и более. Но мыши, которых представил специалист по мышцам биолог Эрик Олсон (Eric Olson) из Юго-западного медицинского центра Техасского университета Далласа вместе со своими коллегами в 2015 году, были исключением. На беговой дорожке мыши преодолевали десятипроцентный подъем в течение примерно полутора часов, пока не начинали спотыкаться. Эти показатели превышали показатели других грызунов на 31%. Эти непобедимые мыши отличались от сородичей одной незначительной деталью: ученые генетически изменили их так, чтобы у них не было одного мышечного протеина. Этого оказалось достаточно для того, чтобы добиться улучшения работы мышц. «Как будто вы отключили тормоза», — говорит Олсон.

Природа ключевого белка оказалась невероятной, поразительной. В мышцах содержится ряд выдающихся протеинов. Дистрофин — структурный протеин, ген которого может содержать мутации, вызывающие мышечную дистрофию, содержит более 3600 аминокислот. Титин, действующий как источник эластичности мышц — это крупнейший известный протеин, он содержит более 34 тысяч аминокислот. Протеин, нейтрализованный у мышей, содержит мизерные 46. Несмотря на то, что ученые более 150 лет исследовали работу мышц, они упустили из виду огромное воздействие этого крошечного протеина, миорегулина, обладающего всего одной функцией, имеющей отношение к мышцам.

Олсон и его коллеги были не единственными, кого поразили крошечные протеины. Как теперь понимают ученые, существовавшие изначально правила анализа геномов исключали идентификацию этих мельчайших молекул. Теперь более обширные критерии и более оптимальные методы выявления позволяют обнаружить тысячи крошечных протеинов, и не только у мышей, но и у многих других видов, в том числе у людей. «Впервые мы стоим на пороге открытия целой вселенной новых протеинов», — говорит биохимик Джонатан Вайссман (Jonathan Weissman) из Калифорнийского университета города Сан-Франциско.

Биологи только начинают подробно изучать функции этих молекул, которые называют микропротеинами, микропептидами или мини-протеинами. При этом их небольшой размер, как представляется, позволяет им вмешиваться в сложную работу более крупных белков, ингибируя одни клеточные процессы и стимулируя другие. Результаты первичных исследований показывают, что микропротеины укрепляют иммунную систему, контролируют разрушение дефектных молекул РНК, защищают бактерии от жары и холода, диктуют период цветения растений, служат источником токсинов многих видов ядов животных. «По всей видимости, во всех биологических процессах задействованы микро [протеины]. Просто раньше мы их не искали», — говорит биохимик Алан Сагателян (Alan Saghatelian) из Института биологических исследований Солка в Сан-Диего, штат Калифорния.

Мини-протеины также могут привести к изменению современного понимания того, что такое геном. Многие из них, как представляется, закодированы в участках ДНК — и РНК — которые, как считалось, не способствуют образованию никаких белков. Некоторые исследователи предполагают, что короткие сегменты ДНК могут быть новорожденными генами, развивающимися в процессе эволюции в более крупные гены, составляющие полноразмерные белки. Отчасти из-за протеинов «мы должны переосмыслить, что такое гены», — говорит микробиолог и молекулярный биолог Гизела Шторц (Gisela Storz) из Национального института здоровья детей и развития человека в Бетесде, штат Мэриленд.

Несмотря на остающиеся загадки, ученые уже тестируют потенциальное применение данных молекул. Одна компания продает инсектициды, полученные из микропротеинов, содержащихся в яде австралийского атрацида. В рамках клинических испытаний проверку проходит контрастное вещество, основанное на другом мельчайшем протеине, содержащемся в яде скорпиона; задача этого вещества состоит в выделении границ опухолей, чтобы хирурги могли извлекать их с большей точностью. Многие фармацевтические компании сейчас ищут микробелки с медицинским потенциалом, говорит биохимик Гленн Кинг (Glenn King) из Университета Квинсленда в Сент-Люсии, Австралия. «Это одна из наиболее стремительно развивающихся отраслей».

Другие короткие цепи аминокислот, часто называемые пептидами или полипептидами, изобилуют в клетках, но они являются урезанными остатками более крупных предков. Миорегулин и его миниатюрные собратья, напротив, появляются на свет маленькими. Насколько они могут быть крошечными, до сих пор неясно. Дрозофилам нужен микропротеин с 11-ю аминокислотами, чтобы у них выросли нормальные лапки, а некоторые микробы могут вырабатывать белки длиной менее десяти аминокислот, отмечает специалист по геномам микробов Эми Бхатт (Ami Bhatt) из Стэнфордского университета в Пало-Альто, Калифорния. Но даже самые крупные микропротеины не дотягивают до протеинов среднего размера, таких как альфа-амилаза, 496-аминокислотного фермента, содержащегося в нашей слюне и расщепляющего крахмал.

Лишь недавнее выявление небольшого количества микропротеинов связано с установленным около 20 лет назад критерием распознавания генов. Когда ученые анализируют геном организма, они часто сканируют открытые рамки считывания (ОРС), которые представляют собой последовательности ДНК, разграниченные сигналами, сообщающими рибосомам клетки, ее конвейерным линиям производства белка, где начать и где остановиться. Отчасти, чтобы не потонуть в огромном объеме данных, в прошлом исследователи, как правило, исключали любую ОРС с протеином меньше, чем 100 аминокислот в эукариотах или 50 аминокислот в бактериях. Например, в дрожжах это условие ограничило список ОРС примерно до шести тысяч.

Ослабление этого критерия показывает, что клетки содержат значительно больше ОРС. Ранее в этом году постдокторант Стэнфорда Хила Сберро Ливнат (Hila Sberro Livnat), Бхатт и их коллеги выявляли фрагменты генома микробов, населяющих четыре части человеческого тела, включая кишечник и кожу. При поиске небольших ОРС, способных кодировать белки длиной от пяти до 50 аминокислот, исследователи выявили около четырех тысяч семейств потенциальных микропротеинов. Почти половина из них не похожа на известные белки, но последовательность одной небольшой ОРС позволяет предположить, что соответствующий белок находится в рибосомах — а это указывает на то, что он может играть какую-то основополагающую роль. Когда ученые упускали из виду маленькие ОРС, «пропускались не просто гены с какими-то редкими функциями, — говорит Бхатт. — Это гены с ключевыми функциями».

Другие клетки также содержат огромное количество коротких ОРС: дрожжи, к примеру, способны произвести более 260 тысяч молекул, обладающих спектром от двух до 99 аминокислот. Но клетки почти наверняка не используют все эти ОРС, и некоторые из производимых ими аминокислотных цепочек могут быть нефункциональными. В 2011 году, обнаружив более 600 тысяч коротких ОРС в геноме дрозофилы, генетик развития Хуан Пабло Кусо (Juan Pablo Couso) из Сассексского университета в Брайтоне, Великобритания, и его коллеги попытались сократить это количество. Они рассудили, что, если конкретная ОРС имеет идентичную или почти идентичную копию у родственного вида, то вероятность того, что она является геномным мусором, будет меньше. После исследования генома другой дрозофилы и анализа других доказательств того, что последовательности преобразуются, группа получила в итоге более удобное количество — 401 короткую ОРС, способную производить микропротеины. Здесь все равно представлена значительная часть протеинов насекомых, содержащая около 22 тысяч полноразмерных белков.

Вайссман с коллегами обнаружили микропротеины другим способом: применив изобретенный ими метод, направленный на более масштабное выявление того, какого рода протеины производят клетки. Чтобы сформировать любой белок, клетка сначала копирует ген в РНК-мессенджер. Затем рибосомы считывают мРНК и связывают аминокислоты в определенном порядке. Путем секвенирования мРНК, прикрепленных к рибосомам, Вайссман и его команда точно определяют, какие из них фактически превращают клетки в белки, и где на РНК рибосома начинает «читать». В исследовании клеток 2011 года ученый со своей командой применил данный метод профилирования рибосомы, называемый также Ribo-seq, к эмбриональным стволовым клеткам мыши и обнаружил, что клетки производят тысячи непредвиденных белков, в том числе многие, в которых количество аминокислот будет ниже порога в 100 единиц. «Было совершенно ясно, что в рамках стандартного подхода игнорировалась обширная вселенная протеинов, многие из которых были короткими», — говорит Вайссман.

Сагателян с коллегами применили третий подход для обнаружения изобилия микропротеинов в наших собственных клетках. Ученые использовали масс-спектрометрический анализ, в рамках которого протеины расщепляются на фрагменты, сортируемые в соответствии с массой, с целью выявления опознавательного спектра каждого протеина. Сагателян и его на тот момент постдокторант Сара Славофф (Sarah Slavoff) вместе с коллегами применили этот метод к смесям протеинов из клеток человека, а потом вычли из них признаки известных видов протеинов. Этим методом были выявлены спектры 86 прежде не выявлявшихся крошечных белков, самые маленькие из которых были длиной в 18 аминокислот, как отмечали ученые в журнале «Нэйче Кемикал Байолоджи» (Nature Chemical Biology) 2013 года.

Маленький размер ограничивает потенциал протеина. Более крупные протеины соединяются в сложные формы, направленные на осуществление определенных функций, например, катализации химических реакций. Протеины, содержащие от 50 до 60 аминокислот, вероятно, не будут образовывать соединений, говорит химик Хулио Камареро (Julio Camarero) из Южнокалифорнийского университета в Лос-Анджелесе. Поэтому, вероятно, они не подходят для образования энзимов или структурных протеинов.

Однако их малые размеры также открывают определенные возможности. «Они достаточно крошечные, чтобы встраиваться в укромные уголки больших белков, которые функционируют как каналы и рецепторы», — говорит Олсон. Маленькие белки часто делят короткие отрезки аминокислот со своими более крупными партнерами и поэтому могут связываться и изменять активность этих белков. Связанные микропротеины могут также направлять большие молекулы в новые места — например, способствуя их проникновению в клеточные мембраны.

Из-за своего притяжения к более крупным протеинам малые протеины могут дать клеткам обратимый способ активирования или дезактивации более крупных протеинов. В исследовании 2016 года, опубликованном в журнале «ПЛОС Дженетикс» (PLOS Genetics), биолог-специалист по развитию растений Стефан Венкель (Stephan Wenkel) из Копенгагенского университета вместе со своими коллегами генетически модифицировали растения Резуховидки (Arabidopsis), чтобы произвести дополнительное количество двух малых протеинов. Растения обычно расцветают в тот период, когда день достаточно продолжителен, но после произведения на свет избыточного количества двух видов микропротеинов цветение задержалось. Малые протеины спровоцировали эту отсрочку, заблокировав запускающий цветение крупный протеин под названием КОНСТАНС (CONSTANS). Они связывают КОНСТАНС с другими ингибиторными протеинами, которые его отключают. «Клетка использует то, что помогает ей выжить. Если с этой задачей справляется короткий протеин, это нормально», — говорит Сагателян.

В сферу выполняемых работ входят и другие ключевые задачи. В 2016 году Славофф, Сагателян и их коллеги выяснили, что клетки человека производят протеин, содержащий 68 аминокислот, который они назвали НиКто (NoBody). Этот протеин может помочь при уничтожении дефективных или ненужных молекул РНК. Название «НиКто» отражает роль этого протеина в предотвращении образования процессивных телец, загадочных кластеров в цитоплазме, где может произойти срыв РНК. Когда не хватает протеина, образуется большее количество процессивных телец, что ускоряет разрушение РНК и изменяет внутреннюю структуру клетки. «Это доказывает, что малые протеины могут оказывать огромное воздействие внутри клетки», — отмечает Славофф.

Мышцы зависят от множества разных микропротеинов. В ходе развития эмбриона отдельные мышечные клетки сливаются в волокна, которые запускают сокращение. 84-аминокислотный белок Миомиксер (Myomixer) объединяется с более крупным белком, чтобы соединить клетки, отмечала команда Олсона в 2017 году в журнале «Сайенс» (Science). Без него зародыши мышей не могут сформировать мышцы и почти прозрачны.

Далее по мере развития в силу вступает миорегулин, способствующий регулированию мышечной деятельности. Когда мышца получает стимул, клеточное хранилище выделяет кальций, стимулируя сокращение тканей и выработку энергии. Далее ионный насос под названием СЕРКА (SERCA) начинает возвращать кальций в хранилище, позволяя мышечным тканям расслабляться. Миорегулин соединяется с СЕРКА и ингибирует его, выяснила команда Олсона. Этот эффект ограничивает частоту сокращения мышц, вероятно, обеспечивая животное запасом энергии на крайний случай, например, при бегстве от хищника. Другой малый протеин, ДВОРФ (DWORF), оказывает обратное воздействие, выпуская СЕРКА и стимулируя систематическое сокращение мышц.

Даже досконально изученные организмы, такие как бактерии кишечной палочки (Escherichia coli) таят неожиданные малые протеины, играющие важную роль. Шторц и ее команда сообщили в 2012 году, что неизвестный до этого 49-аминокислотный белок под названием AcrZ помогает этому микробу выживать при воздействии некоторых видов антибиотиков, стимулируя насос, не допускающий проникновения лекарства.

А яд, производимый разнообразными организмами — в том числе пауками, сколопендрами и ядовитыми моллюсками — изобилует крошечными протеинами. Многие составляющие яда обездвиживают или убивают, блокируя каналы для натрия или других ионов, необходимых для передачи нервных импульсов. Малые протеины «наносят удар по этим ионным каналам с удивительной точностью и мощью, — говорит Кинг. — Они являются главными составляющими ядов, и именно с ними связана большая часть фармакологических и биологических последствий».

Гигантское питающееся рыбой австралийское насекомое, например, не просто полагается на острые челюсти и пикоподобные ротовые части, чтобы одолеть свою добычу. Оно вводит своим жертвам дозу, содержащую более 130 протеинов, в составе 15 из которых менее 100 аминокислот, писал Кинг с коллегами в прошлом году.

В отличие от крупных протеинов, таких как антитела, микропротеины, поступающие в организм из таблеток или инъекций, могут проникать в клетки и модифицировать их функции. Каптоприл, первое из класса лекарств от высокого давления, известное как ингибитор ангиотензинпревращающего энзима, был разработан из малого протеина, содержащегося в яде обыкновенной жарараки. Однако лекарство, одобренное для продажи в Соединенных Штатах в 1981 году Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, было обнаружено случайно, еще до того, как ученые признали малые протеины как отдельную группу. Пока что лишь несколько микропротеинов попали на рынок или на клинические испытания.

Ученые, занимающиеся исследованием рака, пытаются применить микропротеин, содержащийся в яде желтого скорпиона, распространенного в Африке и на Ближнем Востоке. Эту молекулу таинственным образом тянет к опухолям. Добавляя ее к флуоресцентному окрашивающему веществу, ученые рассчитывают подсветить границы опухолей мозга, чтобы хирурги могли безопасно вырезать пораженные раком области. «Она подсвечивает опухоль. Таким образом можно увидеть ее границы и выявить наличие метастаз», — говорит Кинг. В ходе клинических испытаний сейчас исследователи оценивают, поможет ли двойственная молекула хирургам удалять опухоли мозга у детей.

Насколько важную роль малые протеины сыграют в медицине, до сих пор неизвестно, однако они уже перевернули ряд утверждений биологов. Генетик Норберт Хюбнер (Norbert Hübner) из Центра молекулярной медицины Макса Дельбрюка в Берлине вместе с коллегами обнаружили десятки новых микропротеинов в клетках человеческого сердца. Группа выявила неожиданный их источник: короткие последовательности внутри длинных некодирующих РНК, то есть в разновидности, которая, как ранее считалось, не производит протеинов. Идентифицировав 169 длинных некодирующих РНК, вероятно читаемых рибосомами, Хюбнер со своей командой использовал один из видов массовой спектрометрии, чтобы подтвердить, что более половины из них производят микропротеины в клетках сердца. Ранее в этом году об этом результате сообщалось в журнале «Селл» (Cell).

Последовательности ДНК других крошечных протеинов также можно встретить в нетрадиционных местах. Например, некоторые находятся у ОРС более крупных протеинов. Ученые ранее полагали, что эти последовательности помогают контролировать выработку более крупных протеинов, но редко сами производят протеины. Некоторые кодирующие последовательности недавно выявленных микропротеинов кроются даже в последовательностях, кодирующих другие, более длинные протеины.

Эти геномные сюрпризы могут пролить свет на то, как возникают новые гены, говорит биолог-специалист по эволюционным системам Энн-Руксандра Карвунис (Anne-Ruxandra Carvunis) из Питтсбургского университета в Пеннсильвании. Ученые ранее считали, что большинство генов появляется, когда существующие гены размножаются или сливаются, или когда виды обмениваются ДНК. Однако, по мнению Карвунис, микропротеины указывают, что протогены могут формироваться, когда мутации задают новый старт и останавливают сигналы в некодирующей части генома. Если получающаяся в результате ОРС производит полезный протеин, новые последовательности останутся в геноме и пройдут через процесс естественного отбора, в дальнейшем эволюционируя в более крупные гены, кодирующие более сложные протеины.

В исследовании 2012 года Карвунис, занимавшая тогда должность постдокторанта в лаборатории Марка Видала (Marc Vidal) в Институте Даны-Фарбера по изучению рака в Бостоне, вместе с коллегами обнаружила, что дрожжи трансформируют более тысячи коротких ОРС в протеины. А это говорит о том, что эти последовательности являются протогенами. В новом исследовании Карвунис со своей командой провела испытания, могут ли молодые ОРС быть полезны для клеток. Они генетически изменили дрожжи, чтобы увеличить результат из 285 недавно эволюционировавших ОРС, большинство которых ориентированы на молекулы меньшего размера, чем стандартно содержат протеины или немногим больше этого количества. У почти 10% протеинов повышение их уровней усиливало клеточный рост, по меньшей мере, в одной среде.

Славофф до сих пор вспоминает, как она удивилась, когда во время собеседования на позицию постдокторанта у Сагателяна он спросил, не хочет ли она заняться поиском малых протеинов. «Я никогда не думала, что может быть такое количество протеинов, о которых на тот момент нам ничего не было известно».

Но ставка оправдалась: теперь она руководит собственной лабораторией, занимающейся поиском микропротеинов. Недавно несколько ее постдокторантов и выпускников стали заниматься изучением одного из наиболее изученных организмов, штамма E. coli K12. Команда вскоре выявила пять новых микропротеинов. «Вероятно, пока мы копнули лишь то, что лежало на самой поверхности», — говорит она.