Российские ученые получили белок-мутант, излучающий много света
По тому же пути пошёл и коллектив российских исследователей из Института биофизики СО РАН, пытаясь подсмотреть за внутриклеточными процессами. Сибирские учёные клонировали ген, кодирующий люциферазу морских копепод (ракообразных) и модифицировали этот белок, ответственный за свечение этих организмов, с помощью генноинженерных методов. Изучив интенсивность люминесценции таких молекул, исследователи впервые продемонстрировали, что модифицированные белки испускают в 5 раз больше света, чем их природные, не изменённые аналоги. Результаты работы опубликованы в Biochemical and Biophysical Research Communications..
Пожалуй, сегодня не найдётся ни одной крупной фармацевтической компании, которая не использовала бы в доклинических испытаниях лекарственных препаратов биолюминесцентные системы мониторинга. Для того, чтобы выводить эти эксперименты на новый уровень, необходимо ещё более чётко представлять, какие процессы происходят внутри клетки в режиме реального времени. Это довольно сложно, поэтому в мире не так много научных групп ставят перед собой такие задачи. По одному коллективу есть в США, Японии, и России. У нас этими исследованиями занимаются учёные Института биофизики СО РАН. Они решили заглянуть в клетку, используя модифированные светящиеся белки – люциферазы. Их выбор основывался на том, что ранее лаборатория уже работала с геном метридий, кодирующим люциферазу этих организмов.
«В некоторых случаях длительный мониторинг внутриклеточных событий с помощью люцифераз в режиме реального времени сопряжён с определёнными трудностями, особенно, если в качестве белка-репортера используется люцифераза светляков, для биолюминесцентной реакции которой помимо специфического субстрата, люциферина, требуется кислород, АТФ и ионы магния, – поясняет заведующий лабораторией фотобиологии института, руководитель исследования Евгений Высоцкий. – Непросто поддерживать такое большое число компонентов реакции на постоянном уровне внутри клетки. Люцифераза Metridia longa лишена этих недостатков, так как для биолюминесценции необходим только сам светящийся белок, субстрат – целентеразин, и кислород. Кроме того, эта люцифераза относится к классу секретируемых ферментов, т.е. после синтеза в клетке белок «выделяется» клеткой в окружающее пространство. Таким образом, это позволяет проводить мониторинг внутриклеточных событий с высокой чувствительностью без разрушения самих клеток и тканей».
В ходе исследований под руководством Евгения Высоцкого учёные клонировали ген, кодирующий белок из морских копепод Metridia longa, который катализирует реакцию с излучением света. Затем, с помощью генетических манипуляций они направленно изменяли нормальное положение аминокислот в белке, в результате чего получили мутантные формы белка. Кодирующие такие белки нуклеотидные последовательности вставлялись в плазмиды – кольцевые молекулы ДНК, закрученные в сверхспираль и способные к самовоспроизведению в клетке-хозяине. Плазмиды в свою очередь внедрялись в клетки бактерий кишечной палочки Escherichia coli, после чего эти клетки становились способными к синтезу люциферазы метридий. Из них учёные выделяли мутантные формы белка, их очищали и тщательно исследовали.
Как правило, белковые молекулы, или по-другому, ферменты, состоят из различных функциональных участков, порой не вовлечённых непосредственно в процесс катализа. В случае люциферазы из Metridia longa не влияющими на биолюминесцентную активность оказались аминокислоты, расположенные в так называемой N-концевой части люциферазы. Фактически простое усечение N-концевых частей (сторона молекулы, завершающаяся аминогруппой) люциферазы метридий привело к значительному, в пять раз, увеличению интенсивности свечения и эффективности биолюминесцентной реакции. В дополнение авторы показали, что люцифераза метридий с удалённой в определённой позиции аминокислотой хорошо подходит на роль репортерного белка в клетках млекопитающих. Люминесцентный анализ, проводимый с использованием таких белков, показывает большую чувствительность, чем аналогичный анализ с применением природных ферментов.
Как отмечает Евгений Высоцкий, для секретируемых люцифераз увеличение активности за счет усечения фермента продемонстрировано впервые.
Авторы работы участвуют в проекте мегагрантов второй волны по привлечению ведущих ученых для работы в вузах России. (Гранты 16.512.11.2141 и 64987.2010.4 Министерства образования и науки РФ). В рамках этого гранта в Сибирском федеральном университете лабораторию будет создавать лауреат нобелевской премии по химии за открытия в области флуоресцентных белков японец Осаму Шимомура.
Источник информации:
Комментарии 0
