CRISPR стал мощнее, благодаря «выключателю»

При всех своих потрясающих возможностях редактирования генов, механически CRISPR напоминает электроинструмент с поломанным выключателем. Просто вдумайтесь: весь механизм CRISPR выстраивается в пробирке, а после завершения он всегда активен, включен, работает. После введения животным или людям, CRISPR начинает блуждать по всему телу в поисках целевого гена, который должен отредактировать или уничтожить, пока не потеряет силу и не усвоится организмом.

Ослабление контроля молекулярного электроинструмента, очевидно, не будет идеальным решением: он может переусердствовать и поломать нецелевые гены. И если что-то пойдет не так, нет немедленного способа выключить механизм, прежде чем он нанесет ущерб.

В начале этого месяца команда из Калифорнийского университета в Беркли попыталась приручить зверя CRISPR. Используя технику круговой перестановки, команда реорганизовала CRISPR в программируемый инструмент ProCas9, который тихо прячется в клетках, пока его не разбудят внешние факторы — например, вирусная инфекция.

Этот «дополнительный уровень безопасности» ограничивает навыки редактирования CRISPR подмножеством клеток «для точной резки», говорит автор исследования доктор Дэвид Сэвидж.

Более того, ProCas9 может потенциально реагировать на логические входные данные, такие как «и» или «нет», что означает, что он будет активирован только при соблюдении определенного набора инструкций — например, «эта клетка раковая» или «эта клетка инфицирован» приведет к ответу «пожертвовать клеткой», который активирует CRISPR и даст ему указание резать гены, необходимые для выживания. Исследование было опубликовано в престижном журнале Cell.

Давайте слегка освежим в памяти: CRISPR, как инструмент редактирования генов, на самом деле представляет молекулярный дуэт. Первая часть, направляющая РНК, это крошечные кровавые гончие, которые ищут целевой ген.

Как только ген захвачен, второй компонент — Cas9 — активируется для выполнения разрезания. В отличие от направляющих РНК, которые состоят из генетических букв, Cas9 является белком. Именно с этим компонентом решили поиграть ученые из Беркли.

«Широкая цель нашей работы — укротить и для использования людьми и убрать ненужные вещи, не относящиеся к редактированию генома», говорит Сэвидж.

Что же можно сделать с белком? Представьте себе очень длинную цепочку пронумерованных шариков (аминокислот), скомканных в сложную трехмерную структуру. Разрежьте цепь и сможете реорганизовать бусины так, чтобы их положение на нити отличалось от исходного, и сложить их в узел или два при повторном соединение белковой нити.

Именно это, по сути, сделала команда. Этот трюк называется «круговой перестановкой» и преобразует исходный белок так, что у него появляется новое начало и конец — и он складывается в другую форму. Это огромная операция на молекулярном уровне, которая обычно разрушает функцию белка.

Авторы говорят, что не были уверены, что это сработает с чем-то таким сложным, как Cas9.

Удивительно, но Cas9 оказался почти тестом. Команда попыталась  разрезать его в множестве точек, прежде чем найти отрезы, которые сохраняли функцию белка, но в 10% случаев пересобранный Cas9 работал почти так же, как и оригинал.

Здесь есть один умный момент: при повторном соединении белковых нитей команда проскользнула в молекулярные «ворота» — небольшой линкер — которые блокировали режущую способность Cas9, если сам линкер не был сломан.

Что же разбивало цепи? Набор ферментов, называемых протеазами.

Представьте протеазы как крошечные ножницы для белка, которые плавают в теле. Их целая семья: хорошие помогают нам переваривать стейки и бобы. Но есть и плохие. Раковые клетки, например, откачивают свои собственные «злые» протеазы, которые разрывают окружающие ткани, способствуя их росту. Вирусы также могут секретировать вирусные протеазы, что часто необходимо для их проникновения в множественные клетки и ткани. Зика и денге являются одними из тех, кто использует протеазы в качестве своего оружия, а протеазы от заражающих растения вирусов помогают осквернять картофель и другие культуры.

Но протеазы не режут по своему желанию. Скорее, каждая из них предназначена лишь для небольшого числа аминокислотных последовательностей — «почтовых индексов», которые она распознает и разрезает.

Это означает, что команда может поместить определенный почтовый индекс, соответствующий определенной протеазе — например, из раковых клеток — в реорганизованный белок Cas9 в качестве линкера. Таким образом, линкер будет резать только в клетках, которые имеют эту специфическую протеазу, а значит и включаться будет только в этих клетках. В зависимости от направляющей РНК, команда может спроектировать активированный CRISPR, чтобы разрезать гены, необходимые для выживания — и тем самым убивать раковую клетку.

В этом смысле новые белки Cas9, получившие название ProCas9 («pro» из-за «протеазы»), превращаются в крошечные шпионские машины, которые становятся смертельно опасными после активации.

Чтобы проверить концепцию, ученые представили инфицированные Зика клетки своему новому ProCas9, оснащенному направляющими РНК, обученными для поиска генов, поддерживающих жизнь клеток.

Всего за неделю новая система CRISPR уничтожила инфицированные клетки в качестве «альтруистической защиты». Здоровые клетки остались живы и нетронуты.

Это показало, что система оставалась спокойной в мирное время, таким образом, ограничивая геномный ущерб хозяину, говорит авторы.

В отдельных экспериментах система ProCas9 работала так же хорошо, принося в жертву инфицированные вирусом Западного Нила клетки.

«Хотя это очень раннее подтверждение концепции, оно демонстрирует идею того, что это может быть синтетическая иммунная система», говорит автор исследования Бенджамин Оукс. «Мы создали белок, обнаруживающий скрытую угрозу, который можно запрограммировать на что угодно».

Новая система CRISPR вряд ли помешает нашей иммунной системе. Еще одним преимущество перестройки белка является то, что его новые концы лучше переносят грузы, такие как другие модифицирующие ДНК ферменты или индикаторы, светящиеся в темноте.

Будто бы Cas9 обзавелся новой суперсилой, которая позволяет нам отслеживать, где в клетке находится белок, или же менять экспрессию определенных генов — вместо того, чтобы напрямую портить наш генетический материал.

Команда из Беркли уже предусмотрела несколько вариантов использования. ProCas9 будет полезен для молекулярного скрининга или открытия лекарств. Или же он может ограничить обрезание ДНК определенными клетками «после общей доставки редактирующего комплекса в целевую ткань или орган», что значительно повысит профиль безопасности инструмента, особенно в клинических условиях.

Но самое интересное во всем этом то, что мы не привязаны к механизму CRISPR, которым нас наделила природа. Эти белки можно тщательно оптимизировать и посадить в каркасы, не встречающиеся в природе, но обладающие необходимыми свойствами для использования в клетках человека, исследования или лечения, говорит Сэвидж.