Редактирование гена эмбриона человека с помощью метода CRISPR приводит к крупномасштабному беспорядку в хромосомах

Опубликованы три научные статьи, в которых авторы рассказывают о крупномасштабных выпадениях генетического материала хромосомы и перестановках ДНК. Выводы ученых, говорится в статье, усиливают опасения по поводу безопасности технологий редактирования генома.

результате серии экспериментов, в которых модификация человеческих эмбрионов проводилась с помощью инструмента редактирования генов CRISPR-Cas9, ученые установили, что данная технология может вносить значительные и нежелательные изменения в геноме на некотором участке-мишени генома либо вблизи него.

Результаты проведенных исследований были опубликованы в нынешнем месяце на сервере препринтов bioRxiv, однако еще не прошли рецензирование. Вместе с тем, опубликованные статьи дают хорошее представление о том, что, по мнению некоторых ученых, существует недооцененный риск, возникающий при редактировании генома с помощью CRISPR-Cas9. Как показали ранее проведенные эксперименты, данный инструмент редактирования способен вызывать побочные генные мутации на значительном расстоянии от участка-мишени ДНК, однако в недавно проведенных исследованиях были выявлены изменения, которые происходят в соседних с этим участком областях и могут быть не замечены стандартными методами.

«Для нас важнее точные воздействия. Впоследствии их устранить гораздо труднее», — говорит Гаэтан Бурджо (Gaétan Burgio), генетик из Австралийского национального университета в Канберре.

Вероятно, опасения по поводу обеспечения безопасности станут главной темой продолжающихся дебатов о том, могут ли ученые использовать технологии редактирования человеческих эмбрионов для предотвращения генетических заболеваний. Отношение к данной технологии вызывает много вопросов, поскольку с ее помощью создаются необратимые изменения в геноме, которые затем будут передаваться потомкам из поколения в поколение. «Если технологию редактирования эмбрионов человека в репродуктивных целях или редактирования так называемой зародышевой линии можно сравнить с первым полетом человека в космос, то полученные новые данные ученых можно уподобить взрыву ракеты на стартовой площадке прямо перед взлетом», — полагает Федор Урнов (Fyodor Urnov) из Калифорнийского университета в Беркли, который занимается изучением редактирования генома (Федор Урнов не участвовал ни в одном из указанных выше исследований).

Нежелательные эффекты

Первые эксперименты с использованием CRISPR для редактирования человеческих эмбрионов ученые провели еще в 2015 году. С тех пор несколько научных групп в разных странах мира приступили к изучению этой технологии, предназначенной для точного редактирования генов. Однако подобные исследования все еще редки и, как правило, строго регламентированы.

По мнению специалиста в области репродуктивной биологии Мэри Герберт (Mary Herbert) из Ньюкаслского университета (Великобритания), в появившейся недавно научной работе подчеркивается следующее: ученым мало известно о том, каким образом с помощью человеческих эмбрионов происходит починка ДНК, разрезанной с помощью инструментов редактирования генома (это ключевой шаг в редактировании с помощью CRISPR-Cas9). «Нам нужно тщательно разобраться в том, что там происходит, прежде чем мы начнем использовать в ней энзимы, разрезающие ДНК», — добавляет Мэри Герберт.

Первый из препринтов был опубликован в интернете 5 июня специалистом в области биологии развития Кэти Ниакан (Kathy Niakan) из Института Фрэнсиса Крика в Лондоне и ее коллегами. В своем исследовании ученые использовали CRISPR-Cas9 для создания мутаций в гене POU5F1, который оказывает большое влияние на эмбриональное развитие. Из 18 отредактированных эмбрионов около 22% содержали нежелательные изменения, затрагивающие большие участки ДНК, прилегающие к гену POU5F1. В том числе здесь наблюдалась перестройка участков ДНК и большие делеции нескольких тысяч нуклеотидов ДНК — а это намного больше, чем обычно считается среди ученых, использующих данный подход.

Другая группа исследователей, возглавляемая специалистом по стволовым клеткам биологом Дитером Эгли (Dieter Egli) из Колумбийского университета в городе Нью-Йорке, изучала эмбрионы, продуцированные сперматозоидами, которые вызывают мутацию в гене EYS (эта мутация приводит к слепоте). Ученые попытались исправить данную мутацию с помощью CRISPR-Cas9, однако около половины всех протестированных эмбрионов потеряли большие сегменты своей хромосомы (а в некоторых случаях и всю хромосому), на которой расположен ген EYS.

И, наконец, третья группа ученых, возглавляемая специалистом в области репродуктивной биологии Шухратом Миталиповым (Shoukhrat Mitalipov) из Орегонского университета здоровья и науки в Портленде, изучала эмбрионы, полученные с использованием сперматозоидов-носителей мутации, которая вызывает заболевание сердца. Ученые из этой команды тоже, судя по всему, убедились в том, что редактирование генома затрагивает большие области хромосомы, содержащие измененный ген.

Во всех своих исследованиях ученые использовали эмбрионы только для научных целей, а не для индуцирования беременности. Ведущие авторы этих трех научных исследований, результаты которых отражены в препринтах, отказались подробно обсуждать свою работу с отделом новостей журнала "Nature" до тех пор, пока их статьи не будут опубликованы в рецензируемых журналах.

Непредсказуемая репарация

Все зафиксированные изменения возникают в результате репарации ДНК, которая проводится с помощью инструментов редактирования генома. CRISPR-Cas9 с помощью небольшой цепи РНК направляет фермент Cas9 к сайту (сайт — термин, применяемый к любой небольшой части генома, — прим. перев.) с аналогичной последовательностью. Затем фермент разрезает в этом сайте обе цепочки ДНК, а системы репарации клеток устраняют этот разрыв.

Редактирование происходит как раз во время репарации: чаще всего клетка плотно заделывает этот разрыв с помощью механизма, который способен вставлять или удалять небольшое количество нуклеотидов ДНК; правда, этот механизм работает с ошибками. Если ученые вставляют ДНК-шаблон, то клетка может иногда воспользоваться этой последовательностью для исправления разрыва, что приводит к корректной перезаписи. Однако разрезанная ДНК может также перетасовывать или терять большие фрагменты хромосомы.

В предыдущей работе, где технология CRISPR использовалась на эмбрионах мышей и на других видах человеческих клеток, уже было показано, что редактирование хромосом может вызывать значительные нежелательные эффекты. Но, по мнению Урнова, ученым было важно продемонстрировать свои подходы и на человеческих эмбрионах, поскольку разные типы клеток могут по-разному реагировать на редактирование генома.

Такая перестройка участков ДНК могла оказаться не замеченной во многих экспериментах, в которых ученые обычно пытаются найти примеры нежелательного редактирования, скажем, изменение одного нуклеотида ДНК, либо небольшие вставки или делеции небольших фрагментов нуклеотидов. Однако в недавно проведенных экспериментах специально исследовались именно крупные делеции и хромосомные перестройки вблизи участка-мишени. «И научное сообщество отнесется к полученным результатам еще серьезнее, чем раньше, — говорит Урнов. — Эти результаты вовсе не являются случайностью».

Генетические изменения

Команды ученых, которые проводили три описанные выше исследования, по-разному объяснили механизм, лежащий в основе перестроек внутри ДНК. Так, например, исследовательские коллективы Эгли и Ниакана полагают, что бóльшая часть изменений, наблюдавшихся в эмбрионах, объясняются большими делециями и перестройкой участков ДНК. Однако группа Миталипова заявила, что до 40% обнаруженных изменений были вызваны так называемой генной конверсией, при которой в результате процессов репарации ДНК происходит копирование последовательности из одной хромосомы в паре для починки другой.

Миталипов и его коллеги сообщали об аналогичных результатах еще в 2017 году, однако некоторые ученые скептически отнеслись к тому факту, что генная конверсия часто встречается у эмбрионов. Ученые заметили следующее: во-первых, во время генной конверсии материнские и отцовские хромосомы располагаются не рядом друг с другом, а во-вторых, анализы, используемые командой исследователей для определения генной конверсии, могли выявить и другие хромосомные изменения, включая делеции.

Эгли вместе с коллегами в своем препринте хотели непосредственно экспериментально убедиться в наличии генной конверсии, но не смогли ее обнаружить. Бурджо отмечает, что эксперименты, описываемые в препринте Миталипова, аналогичны тем, которые проводились его исследовательским коллективом в 2017 году. По мнению Джин-Су Ким (Jin-Soo Kim), генетика из Сеульского национального университета и соавтора препринта Миталипова, разрывы ДНК в разных местах хромосомы можно исправить и как-то по-иному — таково, по его мнению, одно из возможных решений вопроса.